肠道微生物群的分类变化与软骨损伤相关，与肥胖、高脂肪饮食和关节损伤无关

作者：施云威  北京积水潭医院

脂肪营养不良小鼠在关节损伤后免受软骨损伤。这种保护可以通过植入小脂肪组织移植物来逆转。本研究的目的是评估肠道微生物群与膝关节软骨损伤之间的关系，同时使用脂肪营养不良（LD）小鼠控制肥胖、高脂肪饮食和关节损伤。给LD和同窝对照（WT）小鼠喂食高脂肪饮食、食物饮食，或通过脂肪植入拯救，然后挑战内侧半月板手术的不稳定性，以诱导骨关节炎（OA）。对粪便进行16S rRNA测序。MaAslin2用于确定分类相对丰度和OA严重程度之间的关联。尽管两组之间的血清LPS水平相似，但与所有组相比，HFD WT小鼠四肢的滑液LPS水平均升高，脂肪移植动物除外。与食物相比，HFD和OA救助动物肠道微生物群的拟杆菌：厚壁菌比率显著降低。在肠道微生物群分类群和OA严重程度之间发现了九种新的显著关联。这些发现表明，肠道微生物组与软骨健康之间存在因果关系，与饮食或肥胖无关，通过操纵微生物组提供了潜在的治疗目标。

肠道微生物组与类风湿性关节炎和骨关节炎（OA）的发病机制有关。具体而言，肠道微生物组组成的分类变化与OA的发病和进展有关，尤其与肥胖有关，肥胖是OA的主要危险因素。尽管迄今为止关于肠道微生物群与软骨损伤之间关系的报道在很大程度上是相关的，但来自代谢受损的人类供体的粪便移植加速了膝关节损伤挑战的无菌小鼠的OA，这表明肠道软骨轴在膝关节稳态中起作用，对鹿特丹队列的分析显示，关节疼痛与肠道微生物组中链球菌种类（spp.）的丰度之间存在显著的正相关，这一发现在Lifelines DEEP研究中得到了重复。这种关联被认为是由膝关节内的局部炎症驱动的。然而，由于OA患者通常有多种共病，因此需要在控制其他因素的同时，确定与软骨损伤发病机制相关的肠道微生物变化。

肥胖与几种可能导致OA的因素有关，如肠道微生物群失调、脂肪组织的宿主反应、循环炎症介质和饮食。然而，这些因素在OA发病机制中的相对贡献很难区分。肠道微生物群及其代谢产物是脂肪组织全身炎症的关键调节因子，并参与代谢紊乱的发生和巩固。因此，在脂肪组织缺乏宿主反应的情况下，询问相关结果之间的关系，为研究肠道微生物群在疾病过程中的作用提供了一种直接的方法。使用脂肪营养不良症（LD）小鼠模型，我们证明，先前与肥胖诱导的OA相关的许多因素（即滑膜炎、软骨下骨改变、炎症）确实是可分离的，因为LD小鼠受到保护，免受软骨损伤，高脂肪喂养不会逆转软骨保护表型，也不会加重对照饮食喂养的LD小鼠的代谢失调。此外，LD小鼠的软骨保护可以通过植入少量脂肪组织来逆转。在这方面，比较这些条件下的肠道微生物群提供了评估肠道微生物组变化的机会，同时控制脂肪组织宿主反应、肥胖饮食和OA手术发作。

在本研究中，我们使用粪便微生物群的16S rRNA测序评估了我们先前报道的队列的一个子集，试图分离先前与OA和肥胖相关的因素（即滑膜炎、骨变化、炎症），以评估肠道微生物群和软骨损伤之间的关系。我们假设，当使用LD小鼠控制肥胖饮食的影响和脂肪组织的存在时，肠道微生物群的分类变化与OA严重程度相关。为了增加对肠道微生物群、软骨损伤的再引入和脂肪组织缺失之间关系的评估的机制性见解，我们询问了这些动物的循环和局部内毒素或脂多糖（LPS）水平。该实验设计允许识别与软骨保护逆转和软骨损伤开始相关的肠道微生物群变化。

所有实验程序均按照华盛顿大学圣路易斯医学院比较医学系制定的指南进行，符合ARRIVE指南，并经华盛顿大学圣路易斯学院机构动物护理和使用委员会批准。

通过将脂联素Cre小鼠与纯合子lox-stop lox-ROSA白喉毒素A（DTA）小鼠杂交，建立了LD小鼠11.DTA/ + 野生型（WT）同窝动物作为对照。雄性和雌性小鼠从断奶开始喂食食物对照饮食（10%kcal）或高脂肪饮食（HFD，60%kcal）。这项研究的进一步方法细节可以在原始论文中找到，该论文详细描述了这些小鼠的软骨表型。简而言之，不同基因型的小鼠被共住，以控制肠道微生物群组成中的笼效应。一组LD小鼠在3-5周龄接受小鼠胚胎成纤维细胞移植（MEF-R），形成脂肪样组织，或在6-8周龄接受含有内脏和皮下脂肪的野生型脂肪移植（WF-R）（n = 5–10只动物/性别/组）。在16周时，小鼠接受了左膝内侧半月板（DMM）失稳的手术，而右腿作为非手术对侧对照。在28周时处死后，立即从直肠收集完整的下肢、血清、滑液和单个粪便颗粒。为了评估软骨损伤的严重程度，使用先前报道过的改良曼金评分法（Modified Mankin Score）对番红花-O/快速绿染色切片进行评估。在本研究中，使用Pierce LAL显色内毒素定量试剂盒（Thermofish Scientific）测量血清和滑液LPS浓度。