妙手医生
作者:孟媛 北京市朝阳区六里屯社区卫生服务中心(北京城建老年病医院)
所有三种氨基糖苷类药物对脑膜炎奈瑟菌均表现出杀菌活性,尽管其杀菌活性低于对单核增生乳杆菌的杀菌活性。对于链霉素和庆大霉素,暴露于250 mg/L抗生素90 min后均未检测到活菌。
为了进一步选择合适的抑菌抗生素,我们研究了两种成熟的核糖体靶向抗生素红霉素阻断多肽出口通道和抑制肽键形成的氯霉素对单核增生乳杆菌和脑膜炎奈瑟菌的抑制作用。野生型和耐药的单核增生乳杆菌均暴露于一定范围的氯霉素和红霉素浓度下60 min。与耐药对照组相比,红霉素对野生动物的生长有明显的抑制作用在所有浓度下的单核增生乳杆菌,而对于氯霉素,只观察到很小的不显著的影响。相比之下,在氯霉素或红霉素暴露90 min后,与耐药菌株相比,野生型脑膜炎奈瑟菌的生长均显著受到抑制。
拮抗双抗菌杀菌活性进一步建立反选择方法,依赖于抑菌作用的抑菌抗生素的杀菌抗生素的杀菌活性,生存单核增生乳杆菌和脑膜炎奈瑟菌调查后接触抑菌和杀菌抗生素的组合。野生型和氯霉素或耐红霉素的单核增生乳杆菌暴露于抑菌抗生素氯霉素或红霉素,随后暴露于杀菌抗生素链霉素或庆大霉素。野生型和氯霉素耐药菌株在氯霉素抑制生长后均能以链霉素和庆大霉素的杀菌活性存活,但野生型和耐药菌株的存活率存在显著差异。相比之下,红霉素暴露使野生型菌株的存活率较好,而耐药菌株的存活率均低于两种杀菌抗生素的检出限。同样,氯霉素暴露导致了野生型菌株和对氯霉素耐药的N来自链霉素和庆大霉素杀菌活性的脑膜炎菌株和菌株。然而,虽然红霉素暴露再次抑制了链霉素对野生型菌株和红霉素耐药菌株的杀菌活性程度较小,但野生型菌株的存活低于检测限,尽管野生型菌株的存活良好。因此,对于单核增生乳杆菌和脑膜炎奈瑟菌,红霉素和庆大霉素的联合使用似乎具有理想的反选择作用
应用双抗菌反选择方法,构建两个单核增生乳杆菌和脑膜炎奈瑟菌无标记下缺失突变体。载体向基因组的转化和单次交叉是基于红霉素的挑选经PCR和测序确认单交叉后,选择一个单菌落进一步产生双交叉突变体。在三个生物学上独立的重复中,细菌单交叉重组体培养过夜,随后暴露于红霉素和庆大霉素。细菌悬液被镀上,对于每个独立的生物复制,取100个菌落,并在有和没有红霉素的琼脂上复制。平均而言,13%的单核增生乳杆菌菌落确实失去了红霉素选择标记物,而脑膜炎奈瑟菌的成功率平均为12%。随后的PCR和红菌不敏感菌落测序显示,对于单核增生乳杆菌和脑膜炎奈瑟菌,大约一半的菌落是期望的框内缺失突变体。相比之下,没有红霉素/庆大霉素反选择的单个交叉重组培养物的生长和电镀没有导致任何显示红霉素敏感性的菌落。因此,这种双抗菌反选择方法被证明是一种高效的产生无标记缺失突变体的选择性富集方法。
在不留下永久选择标记的情况下对细菌基因组进行遗传操作,通常采用两步重组方法,即需要广泛筛选单个菌落来选择第二次重组事件或反选择标记。在本研究中,我们提出了一种新的高效反选择方法,它是基于抑菌和杀菌抗生素之间的拮抗作用。我们应用该方法为革兰氏阳性病原体L生成了两个帧内无标记缺失突变体以ermC为抗生素耐药性标记,红霉素和庆大霉素为抑菌和杀菌抗生素。平均成功率为12-13%,将失去整合载体的菌落富集被证明是简单和容易的,这些对红霉素敏感的菌落中大约有一半被证明是理想的突变体。我们报道的成功率高于传统λ-的成功率红色重组系统,报告成功率为0.1-0.2%,但低于galK、thyA和tolC提供的阳性选择,报告成功率为90-100%。然而,我们目前的协议仍然允许进一步的改进。单交叉突变体,保留了载体和选择标记,仍然能够在双抗菌药物治疗中存活下来,尽管数量非常低。由于我们的检测限为104 CFU/mL,我们的抗菌优化方案遗漏了,因为需要在设定的时间点快速稀释100倍,以防止杀菌抗生素进一步杀死。
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